Engineered imaging scaffolds for cryo-EM of small proteins of interest

Sammanfattning: Strukturbestämning av proteiner är viktigt för att kunna förstå deras funktion och en snabbt utvecklande metod inom fältet är kryoelektronmikroskopi. Storleksbegränsningar förhindrar en bredare applikation av metoden eftersom små proteiner har för låg signal i förhållande till bakgrund för att kunna visualiseras som enstaka partiklar i elektronmiksoskopibilder. Hypotesen för projektet är att det är möjligt att avbilda väldigt små proteiner och kringgå den konventionella storleksbegränsningen genom att använda ett bärarprotein ((Putrescine Aminotransferase; YgjG) som kopplas till en affibody (Zwt) genom “helical fusion” och sedan binda ett litet målprotein till denna större struktur. Komplexet ska ge en tillräcklig storlek, symmetri och rigiditet för en lyckad elektronmikroskopi av bärare tillsammans med det lilla icke kovalent bundna målproteinet. För att karaktärisera den föreslagna bäraren, genomförs stabilitetstester genom CD, verifiering av inbindning av målproteinet i SPR, renhetsundersökning med SEC och slutligen kryoelektronmikroskopi för att testa konceptet. Det lilla målproteinet som kommer att avbildas i konceptstudien är en annan affibody (Z963), som i så fall skulle vara det minsta proteinet som någonsin har lösts med kryogenelektronmikroskopi. Resultaten visar att den undersökta tetramera-bäraren är väldigt stabil (Tm~ 85 oC) och kan tolerera en affibody-fusion med bibehållen bindning av multipla säten. Proteinet kan uttryckas rekombinant och renas till högt utbyte och bildar tetramerer även med fuserad affibody. De slutgiltiga resultaten från den kryoelektronmikroskopiska analysen inväntas fortfarande, men lovande griddar har skapats och en partikelselektion har gett klara 2-D klasser som också framhäver att det lilla målproteinet har bundit. Sammanfattningsvis har biofysikalisk karaktärisering indikerat att YgjG är en lovande bas för ett “imaging scaffold” och att preliminära enstaka-partikel kryoelektronmikroskopi analyser visar att den föreslagna strategin att undersöka små målproteiner är möjlig.