Utvärdering av prestanda vid olika reaktionsvolymer med QuantStudio qPCR samt jämförelse mellan två pipetteringsrobotar

Sammanfattning: Introduktion: Polymerase chain reaction (PCR) är en biokemisk och molekylärbiologisk laboratorieteknik som används för in vitro amplifiering av specifika gensekvenser. Det finns olika varianter av PCR, en mer utvecklad version är Realtids-PCR, även benämndkvantitativ PCR (qPCR). qPCR mäter fluorescensintensitet i varje qPCR cykel. Metoden delas in i fyra huvudfaser: linjär-, tidig exponentiell-, exponentiell- och platåfas.   Syfte: Syftet med projektet var att utvärdera prestanda hos Quantstudio 7 vid varierande reaktionsvolym och plattposition, samt vid singleplex och duplex, för att öka kvaliteten på resultat och göra metoden mer kostnadseffektiv.   Material & metod: Syntetisk DNA-sekvens (gBlock) späddes och sattes upp i en standardkurva med sju punkter och användes för 20 µl respektive 10 µl reaktionsvolymen, varje punkt bestod av 4 replikat. För att utvärdera Duplex vs Singelplex förbereddes standardkurva i kombination med en konstant koncentration av en annan assay. För att undersöka intra-plate variation sattes upp identiska reaktioner i samtliga brunnar i PCR-plattan.    Resultat: Samtliga experiment gav detekterbara ampliferingsprodukter.  Cq-värdet användes för att beräkna medelvärde och standardavvikelse, samt effektivitet och R2-värde   Slutsats: Resultatet som erhålls från QS instrumentet visade att reaktionsvolymerna 10 µl och 20 µl är jämförbara. Duplex experimentet visade att gener med låg genuttryck kan duplexas med gener som har 10 000x högre genuttryck. Resultatet från intra-plate variation visade att variationen i SD var högre i den högre sidan av PCR-plattan.