c-cytokromer hos den (per)kloratreducerande bakterien GR-1 : samt en jämförande studie av c-cytokromer från GR-1, Ideonella dechloratans och Dechloromonas aromatica

Sammanfattning: Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas. Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden. Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat.