Bestämning av myosin ATPas med NADH-kopplade mätsystem jämfört med in vitro motilitet med isolerat myosin och aktin

Sammanfattning: SammanfattningSyftet med denna studie var att jämföra NADH-kopplade mätsystem och in vitro motilitets-analys (IVMA) för att bestämma aktiviteten hos isolerat myosin. Från NADH-kopplade analysmätningar bestämdes tre parameter: den maximala hastigheten med vilken myosin hydrolyserar ATP i frånvaro av F-aktin (V0), den maximala ATPas-hastigheten för myosin i närvaro av mättande aktin (kcat) och den koncentration av aktin som behövs för att nå halv maximal aktivering av myosin ATPas-aktivitet (KATPas). Från in vitro-motilitets-analys (IVMA) bestämdes två parametrar: fraktion av rörliga filament (FMF) och totala antalet rörliga filament (TMF). Från detta kunde vi uppskatta den fraktion av aktiva huvuden i myosinpreparationer som behövs för en lyckad IVMA.Myosin är ett protein som tillsammans med aktin är ansvarigt för muskelkontraktionen. I denna studie används två myosin preparationer (HMM-fragment) som vi betecknade ”bra HMM” och ”dåligt HMM” på grund av deras kvalitet för aktin motilitet. Först mättes ATPas-aktiviteten hos myosinmotorer med hjälp av ett NADH-kopplat mätsystem som bygger på övervakning av förändringen i absorbans av NADH. Därefter bestämdes V0, kcat, och KATPas för aktin-beroende av myosin-ATPast genom att mäta myosinaktivitet vid olika aktinkoncentrationer, följt av anpassning av data till Michaelis-Menten ekvationen.Parallellt utfördes IVMA-studier genom att HMM immobiliserades på ett objektglas som derivatiserats med trimetylklorsilan. Sedan observerades när HMM flyttar fram fluorescensmärkta aktinfilament i närvaro av ATP. Under samma förhållanden gav resultaten för basalt myosin ATPas aktivitet V0 värden som var ~0,03 ATP s-1 myosinhuvud -1for både dåligt och bra HMM. I en jämförelse mellan de två HMM vid olika F-aktin-koncentrationer var hastighet i ATP-förbrukningen högre för bra än för dåligt HMM. Anpassning av data till Michaelis-Menten-ekvationen gav kcat på 7,18 ATP s-1myosinhuvud-1för dåligt HMM jämfört med 11,21 ATP s-1 myosinhuvud-1för bra HMM (35 % högre). KATPas (Km) för dåligt HMM var lite högre jämfört med den för bra HMM. Vid IVMA-studierna var FMF och TMF 80 % respektive 98 % lägre för dåligt än bra HMM. Slutsatsen var att de två metoderna karakteriserar HMM-funktionen på olika sätt och med olika känslighet. Om man antar att bra HMM har nästan 100 % aktiva huvuden och eftersom man vet att uppmätt kcat är direkt proportionellt mot antalet aktiva myosinhuvuden ser man från dessa mätningar att mycket mer än 65 % av totalt myosin måste vara aktivt för att ge god aktinmotilitet i en IVMA.