Validering av ELISA för analys av equint IL-1 RA i plasma

Sammanfattning: Detta arbete syftade till att validera en metod för analys av interleukin-1 receptor antagonist (IL-1 RA) i plasma från häst. Med en fungerande analysmetod finns möjligheten att använda IL-1 RA som biomarkör för antiinflammatoriska effekter av läkemedel exempelvis dexametason. En kommersiell ELISA framtagen för analys av IL-1 RA hos häst användes vid valideringen. Analysmetoden var tidigare endast validerad för analys av IL-1 RA i spädningsmedium från tillverkaren. Vid validering av metoden framställdes standardkurvor i spädningsmedium från tillverkaren (reagent diluent=RD) samt i olika biologiska medier från häst. Beräkning av standardkurvorna utfördes med hjälp av linjär regression och innefattade intervallet 0,313 – 20 ng/mL. R2-värden som erhölls för dessa kurvor var i RD: 0,9735 – 0,9961, i RD med dubbel mängd antikroppar jämfört med tillverkarens rekommendationer: 0,9953, i plasma: 0,98, i obehandlat serum: 0,85 och i värmeinaktiverat serum: 0,01. Vid upprepade analyser av standardkurvor i hästplasma (n=6) hade fem av dessa standardkurvor ett R2-värde i medeltal på 0,978. Häst fyra analyserades två gånger och erhöll R2-värden 0,68 och 0,83. Utbytet från plasma som spikades med IL-1 RA var lågt, 25 % vid 10 ng/ml och endast 2 % vid 2,5 ng/ml. Metoden uppvisade stor variation i precision både vid analys i RD och i plasma. Repeterbarheten (%CV) beräknad på duplikat av IL-1 RA-koncentrationer från de olika standardkurvorna var i RD (n=4) 2,7 – 37,5 % (0,313 ng/ml) och 0,1 -5,4 % (20 ng/ml), i RD med dubbel mängd antikroppar (n=1) var CV 79,6 % (0,313 ng/ml) och 1,6 % (20 ng/ml), i serum (n=1) 51 % (0,313 ng/ml) och 1,5 % (20 ng/ml) och i plasma (n=6) 2 -914 % (0,313 ng/ml) och 1-13 % (20 ng/ml). I plasma från häst var CV för repeterbarheten 1-16 % vid 5 ng/ml och inte godtagbar i lägre koncentrationer. Reproducerbarheten (% CV) i RD (n=4) var 105,5 % (0,313 ng/ml) och 5,2 % (20 ng/ml) och i plasma (n=6) 1308 % (0,313 ng/ml) och 6 % (20 ng/ml). Lägsta koncentration med godtagbar reproducerbarhet (CV=14 %) i plasma från häst var 5 ng/ml. Metoden fungerade med godtagbar precision i RD med undantag av den lägsta koncentrationen i standardkurvan där både repeterbarhet och reproducerbarhet uppvisade stora variationer. En förklaring är att linjär regression användes för att beräkna standardkurvan vilket fram för allt innebar att den lägsta koncentrationen blev osäker. Sammanfattningsvis kan inte denna analysmetod användas för undersökning av IL-1 RA koncentrationer i serum och plasma eftersom de lägsta mätbara koncentrationerna med godtagbar precision var > 5 ng/ml. Problemet med metoden var att utbytet från plasma var lågt vilket innebär att den testade metoden blev okänslig och inte tillförlitlig för analys av IL-1 RA i hästplasma.