Utveckling av reningsmetod för cytokrom c-Id1 från Ideonella dechloratans

Sammanfattning: Syftet med arbetet var att utveckla en metod för att rena fram cytokrom c-Id1 ur periplasma från Ideonella dechloratans. Inledningsvis undersöktes proteinets stabilitet vid låga pH. Flera olika kromatografiska metoder provades under arbetets gång. Till de inledande experimenten användes flow-through fraktioner från rening av annat protein som startmaterial. Senare försök gjordes på periplasma från I. dechloratans. Stabilitetsundersökningen gjordes genom att proteinlösningens spektrum registrerades. Lösningen reducerades sedan med ditionit och ett nytt spektrum registrerades. Ett differensspektrum beräknades och absorbansmaximum vid 550 nm användes som mått på mängden cytokrom c-Id1. Undersökningen visade att proteinet är stabilt vid pH ner till 3.0. Första försöken med respektive kromatografisk metod, förutom gelfiltrering, gick ut på att undersöka om proteinet kunde adsorberas till kolonnen eller inte. När proteinet adsorberats till kolonnen ändrades målet med försöken till att försöka eluera det så rent som möjligt. Den slutliga reningsmetoden innehåller tre kromatografiska steg, varav ett behöver optimeras ytterligare för att ge rent protein. Första steget i reningen är katjonbyteskromatografi. Det andra stegetär hydrofob interaktionskromatografi och det sista steget är anjonbyteskromatografi. Efter reningen fanns små mängder föroreningar kvar. Två oönskade proteiner, båda i liten mängd fanns kvar i provet. För att få proteinet helt rent krävs ytterligare optimering av reningsmetoden. Störst potential till förbättring finns troligen i steget med anjonbytaren. Misstankar om att proteinet lätt dimeriserar eller reagerar på annat vis under lagring har funnits under hela arbetet. Resultat från bland annat gelfiltrering har indikerat att så är fallet. Arbetet har inte gettsvar på om cytokrom c-Id1 förändras med tiden eller inte. Bestämning av totala mängden protein samt mängden cytokrom c-Id1 efter reningen gjordes. Dessa analyser visar att 69 μg protein, varav 36 μg cytokrom c-Id1 återstod efter rening från en odling på fyra liter. Halten cytokrom c-Id1 var alltså 52 %.